嚙齒類動物（如大鼠和小鼠）是研究行為機(jī)制的廣泛模式動物。近年來，隨著成像技術(shù)持續(xù)迭代，科研人員得以借助新技術(shù)解析調(diào)控各類動物行為的底層神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，其中鈣成像技術(shù)應(yīng)用尤為突出。依托該技術(shù)，研究者可實(shí)時(shí)觀測神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動模式，追蹤不同行為下神經(jīng)元響應(yīng)的動態(tài)變化。本文將帶您全面了解這項(xiàng)技術(shù)，以及它如何助力動物行為學(xué)相關(guān)研究。

一、什么是鈣成像？

鈣成像技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)觀測、量化單個神經(jīng)元活動，為解析復(fù)雜行為、前額葉皮層、海馬等深部腦區(qū)功能提供關(guān)鍵研究窗口。鈣離子（Ca2?）是核心信號分子，參與神經(jīng)元信號通訊、肌肉收縮、基因表達(dá)等大量細(xì)胞生理過程。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化直接反映細(xì)胞激活狀態(tài)；科研人員通過持續(xù)監(jiān)測神經(jīng)元內(nèi)鈣離子波動，就能解碼對應(yīng)特定行為的神經(jīng)活動規(guī)律。

二、鈣成像的基本原理

鈣成像依靠專用熒光染料或基因編碼鈣指示劑來檢測鈣離子濃度變化，指示劑與鈣離子結(jié)合后會釋放熒光信號，常用的合成染料包括Fluo-4、Rhod-2、Oregon Green BAPTA，基因編碼指示劑則包括GCaMP和R-GECO等。

操作流程如下：

1. 導(dǎo)入指示劑

將選定的鈣指示劑導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。例如，對于神經(jīng)元，可通過注射、膜片微電極（patch pipette）導(dǎo)入，或使用病毒載體表達(dá)基因編碼指示劑。

2. 激發(fā)與檢測

指示劑進(jìn)入細(xì)胞后，用特定波長的光（通常通過熒光顯微鏡）激發(fā)。當(dāng)指示劑與鈣離子結(jié)合后，其自身熒光特性會發(fā)生改變，該變化可通過高靈敏度相機(jī)或光電探測器捕捉記錄。

3. 圖像采集

顯微鏡隨時(shí)間連續(xù)拍攝細(xì)胞時(shí)序圖像，全程記錄熒光強(qiáng)度變化。指示劑熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度成正比 —— 鈣離子濃度升高，熒光增強(qiáng)；濃度降低，熒光減弱。

4. 數(shù)據(jù)分析

對采集到的熒光強(qiáng)度時(shí)序數(shù)據(jù)開展解析，提取細(xì)胞活動核心信息。研究人員可量化鈣瞬變的頻率、幅度與持續(xù)時(shí)長，這些指標(biāo)分別對應(yīng)不同細(xì)胞電生理事件，神經(jīng)元中的鈣瞬變通常直接關(guān)聯(lián)動作電位。

5. 空間與時(shí)間模式觀測

鈣成像可同步觀測多個細(xì)胞，直觀展現(xiàn)鈣活動在空間、時(shí)間維度的分布特征，幫助研究者理清神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部細(xì)胞間的交互規(guī)律。

不過，鈣成像也存在一些局限，包括光毒性（強(qiáng)光損傷細(xì)胞）、光漂白（熒光信號隨時(shí)間衰減）以及指示劑可能干擾細(xì)胞正常功能。此外，指示劑對鈣離子的親和力及結(jié)合/解離速率也會影響測量準(zhǔn)確性。

三、鈣成像與嚙齒類動物行為學(xué)研究

鈣成像實(shí)驗(yàn)會產(chǎn)生海量腦部信號數(shù)據(jù)，想要將神經(jīng)活動與動物行為精準(zhǔn)關(guān)聯(lián)，科研人員通常搭配專業(yè)行為分析軟件工具，例如諾達(dá)思公司推出的動物運(yùn)動軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)。該軟件可在鈣成像同步記錄過程中，精準(zhǔn)追蹤、量化嚙齒動物的全部行為表型。

鈣成像行為研究實(shí)例

1. 社交行為研究：一項(xiàng)發(fā)表于《Nature Communications》的研究利用鈣成像技術(shù)探究了小鼠體內(nèi)血清素能神經(jīng)元在社交行為中的調(diào)控作用。研究者整合鈣成像記錄與行為分析手段，觀察特定血清素能神經(jīng)元群體的活動如何影響小鼠社交互動行為。該研究揭示了血清素能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)社交行為中的重要性，為社交互動的神經(jīng)機(jī)制提供了新見解。

2. 威脅感知研究：另一項(xiàng)發(fā)表于《Cell Reports》的研究檢測了小鼠遭遇危險(xiǎn)刺激時(shí)杏仁核的神經(jīng)活動。研究者發(fā)現(xiàn)丘腦旁細(xì)胞下旁束核、腦橋外側(cè)臂旁核兩大腦區(qū)，均存在表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的神經(jīng)元。這類神經(jīng)元可接收多感官通道的危險(xiǎn)信號，并向杏仁核不同分區(qū)傳遞負(fù)性情緒信號。研究表明，兩類 CGRP 神經(jīng)元及其投射至杏仁核的神經(jīng)連接，是動物感知多模態(tài)危險(xiǎn)刺激、形成厭惡記憶的核心結(jié)構(gòu)。該成果揭示了先天威脅感知統(tǒng)一神經(jīng)通路，有望為先天性恐懼相關(guān)精神疾病的治療提供新思路。

四、鈣成像結(jié)合行為研究的優(yōu)勢

1. 實(shí)時(shí)動態(tài)捕捉：鈣成像能夠?qū)崟r(shí)記錄神經(jīng)元活動動態(tài)變化，直觀觀測特定行為如何激活不同神經(jīng)元集群，并完整追蹤神經(jīng)活動時(shí)序變化。通過對比探索、社交、恐懼應(yīng)激等不同行為狀態(tài)下的神經(jīng)信號，能夠深入拆解復(fù)雜行為背后的底層神經(jīng)機(jī)制。

2. 深腦區(qū)研究：鈣成像技術(shù)可用于觀測前額葉皮層、海馬等調(diào)控核心行為的深部腦區(qū)，清晰闡明這類腦區(qū)神經(jīng)活動如何調(diào)控動物外在行為輸出。

3. 藥效評估應(yīng)用：鈣成像還能評估各類治療干預(yù)方案的實(shí)際效果。研究者可長期持續(xù)監(jiān)測靶標(biāo)腦區(qū)的神經(jīng)活動，判斷藥物給藥、腦深部電刺激等干預(yù)措施對神經(jīng)環(huán)路動態(tài)、動物行為帶來的影響。

五、鈣成像研究中的其他常用模式物種

除小鼠、大鼠外，多種模式生物同樣廣泛應(yīng)用于鈣成像行為學(xué)研究，各自適配獨(dú)特的行為研究方向：

斑馬魚

胚胎與幼魚通體透明，可實(shí)現(xiàn)非侵入式活體神經(jīng)活動成像；體型小巧、發(fā)育速度快，十分適配高通量行為篩選實(shí)驗(yàn)。例如，斑馬魚幼魚鈣成像相關(guān)研究，已為個體化癲癇治療提供了潛在線索。

果蠅

神經(jīng)系統(tǒng)研究經(jīng)典模型，神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)清晰，行為多樣（求偶、運(yùn)動、學(xué)習(xí)、記憶）。鈣成像有助于解析相關(guān)行為的神經(jīng)回路?？蓞⒖糚atel等人（2022）的研究，他們結(jié)合鈣成像和EthoVision XT分析了動物如何感知無害或潛在有害刺激。

秀麗隱桿線蟲

雖體型微小、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，擁有獨(dú)特研究優(yōu)勢；但線蟲固定操作難度高，為鈣成像實(shí)驗(yàn)帶來較大挑戰(zhàn)。目前已有研究開發(fā)出利用海藻酸鈉凝膠捕獲線蟲的全新固定方法，大幅優(yōu)化該物種實(shí)驗(yàn)條件。

斑胸草雀

鳴禽，以復(fù)雜的發(fā)聲學(xué)習(xí)行為著稱。一項(xiàng)研究通過鈣成像和雙光子顯微鏡，追蹤了從高級腦區(qū)到肌肉運(yùn)動的發(fā)聲過程，發(fā)現(xiàn)前腦結(jié)構(gòu)HVC中的前運(yùn)動神經(jīng)元在歌唱的特定時(shí)間點(diǎn)被激活。

六、總結(jié)

總之，鈣成像結(jié)合單光子或雙光子成像技術(shù)，將在嚙齒動物行為及其神經(jīng)相關(guān)性研究中持續(xù)發(fā)揮關(guān)鍵作用。該技術(shù)以高空間分辨率測量神經(jīng)元活動的能力尤為突出，不僅能記錄單個神經(jīng)元的活動，還能精確定位參與特定行為的神經(jīng)元和腦區(qū)。

這些發(fā)現(xiàn)有助于闡明行為的神經(jīng)基礎(chǔ)，并可能為未來治療應(yīng)用提供潛在靶點(diǎn)。隨著諾達(dá)思的動物運(yùn)動軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)和鼠類家居行為活動觀測箱(PhenoTyper)等工具的不斷進(jìn)步，它們可與鈣成像系統(tǒng)無縫集成，使研究者能夠在自由活動的小鼠和大鼠中分析和解讀鈣成像數(shù)據(jù)，進(jìn)一步深化我們對行為的理解。

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